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2024國(guó)抽項(xiàng)目：食品中三氯蔗糖的測(cè)定

       2024年食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則中要求對(duì)醬油、食醋、釀造醬、葡萄酒等14種食品進(jìn)行三氯蔗糖測(cè)定，其中冷凍飲品、其他蒸餾酒檢驗(yàn)項(xiàng)目中，三氯蔗糖作為2024年新增項(xiàng)目。檢測(cè)方法中均選定GB 22255-2014、GB 5009.298-2023兩個(gè)食品安全國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，并要求2024年3月6日之前使用GB 22255-2014檢測(cè)，2024年3月6日（含）之后使用GB 5009.298-2023檢測(cè)，或根據(jù)檢驗(yàn)日期選擇現(xiàn)行有效的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

       《GB 5009.298-2023 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測(cè)定》于2023年9月6日發(fā)布，2024年3月6日實(shí)施，替代《GB 22255-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測(cè)定》。新標(biāo)準(zhǔn)與老標(biāo)準(zhǔn)相比，第一法高效液相色譜法調(diào)整了樣品分類、稱樣量范圍、檢出限和定量限，仍然保留了75%甲醇水提取濃縮、液液萃取等復(fù)雜的前處理過程；增加了第二法"高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法"。

         迪馬科技多年來一直關(guān)注食品中三氯蔗糖測(cè)定的相關(guān)問題，并提供完整的解決方案。之前發(fā)布過三氯蔗糖解決方案，參考標(biāo)準(zhǔn)《GB 22255-2014》重現(xiàn)了國(guó)標(biāo)方法，詳細(xì)解決方案可去迪馬科技查詢：食品中三氯蔗糖的測(cè)定——HPLC法解決方案。

        參考即將實(shí)施的標(biāo)準(zhǔn)《GB 5009.298-2023食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測(cè)定》重現(xiàn)了國(guó)標(biāo)方法，并對(duì)醬油、醋、甜面醬等容易產(chǎn)生雜質(zhì)干擾的樣品，以及高含量樣品，進(jìn)行前處理方法優(yōu)化。

       優(yōu)化方案中乙酸鉛作為沉淀劑，純水提取，可避免標(biāo)準(zhǔn)中提取為75%甲醇水溶液濃縮時(shí)間長(zhǎng)、液液萃取等復(fù)雜過程，簡(jiǎn)化了前處理流程，提高了樣品檢測(cè)效率。兩種檢測(cè)方法如下：

第一法：高效液相色譜法：

采用ProElut^® PLS 200mg/6mL(Cat.#:68012)凈化，Bio-Bond^® C18 250×4.6mm，5μm(Cat.#:84006)色譜柱分離，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)。

第二法：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法采用ProElut^® PLS 200mg/6mL(Cat.#:68012)凈化，Leapsil^® C18 100x4.6mm，2.7μm(Cat.#:86002)色譜柱分離測(cè)定，以下為部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，供廣大客戶參考。

 

第一法：高效液相色譜法

一、國(guó)標(biāo)重現(xiàn)實(shí)驗(yàn) GB 5009.298-2023

1、適用范圍
本方案適用于紅酒、棒棒糖、蜜餞、綠豆糕、醬油、醋和甜面醬中三氯蔗糖的檢測(cè)，紅酒方法定量限20mg/kg，棒棒糖、蜜餞、綠豆糕、醬油、醋和甜面醬方法定量限30mg/kg。

2、提取
2.1 液態(tài)酒類試樣（紅酒）

2g樣品，旋蒸至干，用1mL水溶解，經(jīng)0.45μm親水PTFE濾膜過濾后，待測(cè)。

2.2 糖果、蜜餞試樣（棒棒糖、半邊梅）

2g樣品，加入5mL水，振蕩3min，加入15mL甲醇，0.5mL乙酸鋅和0.5mL亞鐵氰化鉀溶液，繼續(xù)振蕩30s，經(jīng)60℃水浴加熱15min，超聲提取20min，3000rpm離心10min，將上清液移入50mL離心管中，沉淀物加入5.0mL甲醇水（75+25），振蕩30s，3000rpm離心10min，重復(fù)提取2次，合并上清液。將全部上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入30mL正己烷，振搖2min，靜置分層20min，取下層液體在50℃下減壓蒸至1mL左右，用9mL水分3次沖洗旋蒸瓶，沖洗液合并至15mL離心管中，超聲處理5min，3000rpm離心10min，待凈化。

 

2.3 醋、醬油、醬及醬制品類試樣（醬油、醋、甜面醬）

2g樣品，加入1.0g中性氧化鋁，加入5mL水，振蕩3min，加入15mL甲醇，繼續(xù)振蕩30s，超聲提取20min，3000rpm離心10min，將上清液移入50mL離心管中，沉淀物加入5.0mL甲醇水（75+25），振蕩30s，3000rpm離心10min，重復(fù)提取2次，合并上清液。將全部上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入30mL正己烷，振搖2min，靜置分層20min，取下層液體在50℃下減壓蒸至1mL左右，用9mL水分3次沖洗旋蒸瓶，沖洗液合并至15mL離心管中，超聲處理5min，3000rpm離心10min，待凈化。

 

2.4 其他試樣（綠豆糕）

2g樣品，加入5mL水，振蕩3min，加入15mL甲醇，0.5mL乙酸鋅和0.5mL亞鐵氰化鉀溶液，繼續(xù)振蕩30s，超聲提取20min，3000rpm離心10min，將上清液移入50mL離心管中，沉淀物加入5.0mL甲醇水（75+25），振蕩30s，3000rpm離心10min，重復(fù)提取2次，合并上清液。將全部上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入30mL正己烷，振搖2min，靜置分層20min，取下層液體在50℃下減壓蒸至1mL左右，用9mL水分3次沖洗旋蒸瓶，沖洗液合并至15mL離心管中，超聲處理5min，3000rpm離心10min，待凈化。

3、標(biāo)準(zhǔn)品配制
標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品，用水配制成10mg/mL的儲(chǔ)備液，吸取一定體積10mg/mL儲(chǔ)備液用水配成濃度為1000μg/mL的儲(chǔ)備液。

4、凈化
ProElut^® PLS 200mg/6mL（Cat.#:68012）

(1)活化：依次向柱中加入4mL甲醇、4mL水，棄去流出液；

(2)上樣：將待凈化液加入柱中，棄去流出液（控制流速不超過每秒1滴）；

(3)淋洗：柱上液面為2mm左右時(shí)加入1mL水；

(4)洗脫：3mL甲醇洗脫;

(5)定容：將洗脫液在50℃下減壓蒸干，用乙腈水（11+89）定容至1mL，疏水PTFE濾膜過濾，供HPLC分析。

5、色譜條件
色譜柱：Bio-Bond^® C18 250×4.6mm，5μm（Cat.#:84006）

流速：1.0mL/min

進(jìn)樣量：20μL

柱溫：35℃

檢測(cè)器：ELSD

溫度：40℃

壓力：4.0bar

Gain：4

流動(dòng)相：A：水；B：乙腈，A:B=89:11。

當(dāng)檢測(cè)樣品基質(zhì)復(fù)雜，強(qiáng)保留物質(zhì)影響后續(xù)檢測(cè)時(shí)，可采取梯度洗脫程序，梯度設(shè)置如下：

6、添加回收結(jié)果及色譜圖

 

 

7、小結(jié)
參考即將實(shí)施的標(biāo)準(zhǔn)《GB5009.298-2023食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測(cè)定》，重現(xiàn)了國(guó)標(biāo)方法，除醬油樣品，回收率均在80%-120%之間，醬油樣品回收率為78.8%，偏低；第一法5.2.2 醋、醬油、醬及醬制品類試樣基線不平，低濃度不便于定量。

 

二、方法優(yōu)化實(shí)驗(yàn) GB 5009.298-2023

1、適用范圍
本方案適用于醬油、醋、甜面醬中三氯蔗糖的檢測(cè)，方法定量限30mg/kg。(針對(duì)國(guó)標(biāo)方法重現(xiàn)GB 5009.298-2023第一法5.2.2 醋、醬油、醬及醬制品類試樣在目標(biāo)峰出峰位置附近雜質(zhì)干擾、基線不平，低濃度不便于定量的問題，對(duì)前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化和簡(jiǎn)化。）

2、提取
2g樣品，加入8mL 水和2mL 200g/L乙酸鉛溶液，振蕩2min，超聲提取5min，6000rpm離心5min，取10mL上清液，待凈化。

3、標(biāo)準(zhǔn)品配制
標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品，用水配制成10mg/mL的儲(chǔ)備液，吸取一定體積10mg/mL儲(chǔ)備液用水配成濃度為1000μg/mL的儲(chǔ)備液。

4、凈化
ProElut^® PLS 200mg/6mL（Cat.#:68012）

(1)活化：依次向柱中加入5mL甲醇、5mL水，棄去流出液；

(2)上樣：將待凈化液加入柱中，棄去流出液（控制流速不超過每秒1滴）；

(3)淋洗：向柱中加入5mL 20%甲醇水溶液，棄去流出液；

(4)洗脫：向柱中加入3mL甲醇，收集流出液；

(5)定容：將洗脫液在50℃下減壓蒸干，用流動(dòng)相定容至1mL，疏水PTFE濾膜過濾，供HPLC分析。

5、色譜條件
色譜柱：Bio-Bond^® C18 250×4.6mm，5μm（Cat.#:84006）

流速：1.0mL/min

進(jìn)樣量：20μL

柱溫：35℃

檢測(cè)器：ELSD

溫度：40℃

壓力：4.0bar

Gain：4

流動(dòng)相：A:水；B:乙腈，A:B=89:11。

當(dāng)檢測(cè)樣品基質(zhì)復(fù)雜，強(qiáng)保留物質(zhì)影響后續(xù)檢測(cè)時(shí)，可采取梯度洗脫程序，梯度設(shè)置如下：

6、添加回收結(jié)果及色譜圖

 

 

 

 

7、小結(jié)
對(duì)前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化和簡(jiǎn)化后，相比于GB 5009.298-2023第一法，醬油樣品和甜面醬樣品基線更平、目標(biāo)峰附近無雜質(zhì)干擾，便于定量，但高水平加標(biāo)醬油樣品，回收率偏低。

三、醬油樣品優(yōu)化實(shí)驗(yàn) GB 5009.298-2023

1、適用范圍
本方案適用于醬油中三氯蔗糖的檢測(cè)，方法定量限30mg/kg。(針對(duì)已優(yōu)化方法中醬油的高水平加標(biāo)回收率低的問題，對(duì)前處理過程再次進(jìn)行優(yōu)化，并把添加水平提高到2000mg/kg。）

2、提取
分別稱取0.25g、0.5g、1g、2g樣品，加入8mL 水和2mL 200g/L乙酸鉛溶液，振蕩2min，超聲提取5min，6000rpm離心5min，取10mL上清液，待凈化。

3、標(biāo)準(zhǔn)品配制
標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品，用水配制成10mg/mL的儲(chǔ)備液，吸取一定體積10mg/mL儲(chǔ)備液用水配成濃度為1000μg/mL的儲(chǔ)備液。

4、凈化
ProElut^® PLS 200mg/6mL（Cat.#:68012）

ProElut^® PLS 500mg/6mL（Cat.#:68005）

(1)活化：依次向柱中加入5mL甲醇、5mL水，棄去流出液；

(2)上樣：將待凈化液加入柱中，棄去流出液（控制流速不超過每秒1滴）；

(3)淋洗：向柱中加入5mL 20%甲醇水溶液，棄去流出液；

(4)洗脫：向柱中加入3mL甲醇，收集流出液；

(5)定容：將洗脫液在50℃下減壓蒸干，用流動(dòng)相定容至1mL，疏水PTFE濾膜過濾，供HPLC分析。

5、色譜條件
色譜柱：Bio-Bond^® C18 250×4.6mm，5μm（Cat.#:84006）

流速：1.0mL/min

進(jìn)樣量：20μL

柱溫：35℃

檢測(cè)器：ELSD

溫度：40℃

壓力：4.0bar

Gain：4

流動(dòng)相：A：水；B：乙腈，A:B=89:11。

當(dāng)檢測(cè)樣品基質(zhì)復(fù)雜，強(qiáng)保留物質(zhì)影響后續(xù)檢測(cè)時(shí)，可采取梯度洗脫程序，梯度設(shè)置如下：

6、添加回收結(jié)果及色譜圖

 

7、小結(jié)
加標(biāo)水平為2000mg/kg 醬油樣品中，PLS小柱填料質(zhì)量由200mg提高到500mg后，優(yōu)化后方法的回收率由71.5%提高到82.2%；樣品稱樣量由2g降低到0.25g，優(yōu)化后方法的回收率由71.5%提高到100.7%。

總結(jié)

1. 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.298-2023第一法重現(xiàn)的結(jié)果中，前處理方法5.2.2 醋、醬油、醬及醬制品類試樣在目標(biāo)峰位置出現(xiàn)基線不平不便于定量的問題，使用優(yōu)化方法后，醬油和甜面醬樣品在三氯蔗糖目標(biāo)峰附近基線更平，無雜質(zhì)干擾，便于定量，并簡(jiǎn)化了流程提高了實(shí)驗(yàn)效率。

2. 加標(biāo)水平為2000mg/kg 醬油樣品中，PLS小柱填料質(zhì)量由200mg 提高到500mg后，優(yōu)化后方法的回收率由71.5%提高到82.2%；樣品稱樣量由2g降低到0.25g，優(yōu)化后方法的回收率由71.5%提高到107.7%，由此可見，增加填料質(zhì)量或者降低稱樣量可以提高回收率，客戶可根據(jù)對(duì)回收率的要求，進(jìn)行選擇。

3. 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器作為質(zhì)量型檢測(cè)器，響應(yīng)值與溶質(zhì)顆粒大小和數(shù)量有關(guān)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制對(duì)數(shù)回歸曲線，并測(cè)試線性范圍。本次實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線取20、50、200、500、1000μg/mL，相關(guān)系數(shù)R= 0.9979365；當(dāng)加入5000μg/mL時(shí)，R= 0.9940418，客戶可根據(jù)自身對(duì)曲線相關(guān)系數(shù)的要求選擇是否加入濃度為1000μg/mL以上濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。

 

第二法：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

國(guó)標(biāo)重現(xiàn)實(shí)驗(yàn) GB 5009.298-2023

1、適用范圍
本方案適用白酒、紅酒、糖果、醬油、醋、甜面醬、餅干中三氯蔗糖的檢測(cè)。

2、標(biāo)準(zhǔn)品配制
(1) 三氯蔗糖儲(chǔ)備液：稱取蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品0.25g，用水溶解并定容至25mL，配置成濃度為10.0mg/mL的儲(chǔ)備液。

(2) 三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取適量三氯蔗糖儲(chǔ)備液，用水稀釋并定容，配置成濃度為100μg/mL的工作液。

3、提取
3.1 白酒樣品

稱取混勻后的白酒2g至10mL容量瓶，用水定容至刻度線，試樣過Nylon膜（Cat.#:37177），上機(jī)分析。

 

3.2 紅酒樣品

稱取混勻后的紅酒2g于蒸發(fā)皿中，60℃水浴上加熱30min，用10mL水分3次沖洗蒸發(fā)皿的殘?jiān)?，沖洗液全部轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，用水定容至刻度并搖勻，待凈化。

3.3 糖果樣品

稱取2g樣品于50mL離心管中，加入10mL水，渦旋振蕩3min，加入1mL乙酸鋅溶液、1mL亞鐵氰化鉀溶液，經(jīng)60℃水浴加熱15min，水浴過程中注意搖散。超聲提取20min，8500r/min離心5min，取上清于25mL容量瓶中，10mL水重復(fù)提取1次，合并提取液，加水定容至刻度，混勻后轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，加入15mL正己烷，渦旋振蕩3min，8500r/min離心5min，棄去上層正己烷，下層清液待凈化。

 

3.4 餅干、醬油、醋

稱取2g樣品于50mL離心管中，加入10mL水，渦旋振蕩3min，加入1mL乙酸鋅溶液、1mL亞鐵氰化鉀溶液，超聲提取20min，8500r/min離心5min，取上清于25mL容量瓶中，10mL水重復(fù)提取1次，合并提取液，加水定容至刻度，混勻后轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，加入15mL正己烷，渦旋振蕩3min，8500r/min離心5min，棄去上層正己烷，下層清液待凈化。

乙酸鋅溶液：稱取21.9g乙酸鋅，加3mL乙酸，加水溶解至100mL。

亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6g亞鐵氰化鉀,加水溶解至100mL。

4、凈化
ProElut^® PLS 200mg/6mL（Cat.#:68012）

(1)活化：用4mL甲醇、4mL水活化；

(2)上樣：準(zhǔn)確移取10mL試樣提取液過柱，控制流速不超過1滴/s，棄去流出液，推干小柱；

(3)洗脫：加入3mL甲醇洗脫，并收集洗脫液到10mL容量瓶中，加水定容，混勻，過Nylon膜（Cat.#:37177），上機(jī)分析。

5、色譜條件
(1) UPLC條件

色譜柱：Leapsil^® C18 100x4.6mm, 2.7μm （Cat.#:86002)

流速：0.6mL/min  

進(jìn)樣量：1μL

柱溫：40℃

流動(dòng)相：A: 水  B:甲醇

梯度設(shè)置：

(2) 質(zhì)譜條件

電離模式：ESI

掃描方式：負(fù)離子掃描

檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)

電噴霧電壓：-4500V

霧化氣壓力：50psi

輔助氣壓力：50psi

氣簾氣壓力：20psi

離子源溫度：500℃

6、添加回收結(jié)果及色譜圖

 

 

 

 

 

 

 

 

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